Monday, 15 August 2016

Peranan Penanda Molekular dalam Analisa Keragaman Genetik

Peranan Penanda Molekular dalam Analisa Keragaman Genetik

A. Peranan Penanda Molekular

Sejak ditemukannya suatu metode pelipatgandaan DNA secara in-vitro yang dikenal dengan Polymerase Chain Reaction (PCR), telah banyak pula berkembang teknik molekular berdasarkan PCR. Penemuan teknik-teknik molekular tersebut sangat membantu dalam perkembangan bidang ilmu Biologi molekular sehingga variasi makhluk hidup dapat langsung dideteksi pada tingkat gen, bukan hanya pada tingkat morfologi.

Teknik marka molekular dilakukan dengan cara mengidentifikasi tanaman atas dasar keberadaan sekuen DNA spesifik atau perbedaan kombinasi sekuen antar individu tanaman. Ada bermacam-macam metode yang dikelompokan menjadi dua yaitu: 1). penanda DNA tanpa PCR (non-PCR based technique) seperti RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), 2). penanda DNA berdasarkan PCR yang meliputi RAPD (Random Amplified Polymorphyc DNA), AFLP ( Amplified Fragment Lenght Polymorphism), SSRs (Simple Sequence Repeats), CAPS (Cleaved Amplified Ploymorphic Sequence), dan DNA Bacording (Zulfahmi, 2013).

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) merupakan teknik yang banyak digunakan dalam mempelajari variasi inter maunpun antar spesies dengan memanfaatkan enzim restriksi, teknik ini dapat mendeteksi adanya variasi genetik dengan akurat. Posisi dan besarnya variasi dapat diperkirakan dengan tepat (Sutarno, 1999).

Hasil pemotongan genom menggunakan enzim restriksi tertentu akan menghasilkan perbedaan panjang fragment DNA. Genom yang telah terfragmentasi kemudian dapat dianalisis. Melalui analisis selanjutnya dapat diketahui apakah pada sekuen target telah terjadi perubahan akibat adanya subtitusi basa (nukleotida), insersi, delesi, ataupun translokasi. Keuntungan dari penanda RFLP adalah pada umumnya bersifat kodominan yaitu dapat mendeteksi alel heterozigot dan homozigot, dan kekurangan dari teknik ini yaitu, memerlukan jumlah DNA yang lebih banyak, waktu yang lebih lama, memerlukan enzim restriksi yang spesifik dan menggunakan radioaktif yang telah diketahui tidak ramah dengan lingkungan (Pandin, 2010).

RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) merupakan salah satu penanda DNA yang dapat digunakan untuk mengkarakterisasi dan mempelajari keragaman genetik. RAPD dihasilkan melalui amplifikasi DNA berdasarkan Polymerase Chain Reaction (PCR). Hasil RAPD dipisahkan melalui teknik elektroforesis dan diwarnai dengan menggunakan pewarna DNA sehingga terlihat berbagai ukuran pita DNA (Arisetianingsih et al.,2010).

Metode RAPD mampu mendeteksi sekuen nukleotida dengan hanya menggunakan satu primer yang bersifat universal (dapat digunakan untuk sel prokariot dan eukariot). Primer tersebut akan berikatan dengan utas tunggal genom yang satu dan pada utas DNA pasangannya dengan arah yang berlawanan. Kelebahan lainnya dari pengguaan teknik ini yaitu mampu menghasilkan karakter yang relatif tidak terbatas jumlahnya, bahan-bahan yang digunakan relatif lebih murah, preparasi lebih mudah, dan memberikan hasil lebih cepat dibandingkan dengan analisis molekular lainnya (Weising et al., 1995).

AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism) merupakan penanda yang merupakan gabungan dari teknik dan RFLP. Penanda AFLP didasarkan pada amplipikasi selektif potongan DNA hasil restriksi genomik total dengan enzim restriksi endonuklease. Keunggulan teknik ini antara lain tidak memerlukan informasi sekuen dari genom dan perangkat oligonukleotida yang sama ketika dianalisis dan dapat diamplifikasi pada semua organisme termasuk tanaman, dengan hasil amplifikasi yang yang bersifat stabil, tingkat pengulangan dan variabilitasnya sangat tinggi (Vos et al.,1995). Kekurangan dari teknik ini adalah memerlukan waktu yang lebih lama dan keahlian khusus karena proses aplikasinya relatif lebih rumit, serta alat dan bahan yang digunakan sangat mahal (Dewi, 2008).

SSR (Simple Sequence Repeats) merupakan nama lain dari penanda mikrosatelit, mikrosatelit merupakan fragment DNA berulang sedrhana atau pendek, mikrosatelit memiliki unit berulang berkisar 1-6 base pair. SSR terdapat sangat banyak dan membayar di dalam genom, dan banyak digunakan pada tanaman (Pandin, 2010).

SSR memberikan kandungan informasi yang tinggi, pada umumnya pada lokus tunggal, bersifat kodominan, membutuh jumlah DNA yang sangat sedikit, relatif sederhana, dan deteksi yang didasarkan pada PCR menandakan bahwa SSR merupakan alat ideal untuk banyak aplikasi genetika (Karp et al.,1995; Rivera et al.,Saghai-Maroof et al., 1994; Morgante dan Olivieri, 1993).

CAPS (Cleaved Amplifed Polymorphic Sequences) merupakan kombinasi dari teknik RFLP dengan PCR, teknik ini digunkan untuk mengatsi kebutuhan DNA yang diperlukan dalam jumlah besar pada teknik RFLP, serta teknik ini akan mempersingkat waktu restriksi selama 24 jam menjadi 2-3 jam, hal ini akan mengefesiensikan waktu dalam proses menganalisis sample (Pandin 2010).

Kelebihan dari penanda CAPS yaitu: (1). membutuhkan kuantitas DNA template yang rendeh (50-100 ng per reaksi) untuk PCR, (2). bersifat kodominan (Matsumoto dan Tsumara, 2004) dan lokus spesifik sehingga dapat digunakan untuk membedakan indifidu homozigot dan hiterozigot, (3). tidak menggunakan radioaktif. Kelemahan penanda ini adalah: (1). dibutuhkan informasi sekuen DNA dalam mendesain primer spesifik untuk PCR; (2). sulit mendapatkan pola pita polimorfik karena ukuran fragment hasil amplifikasi PCR yang pendek yaitu 300-1800 bp serta terbatasnya mutasi, sehingga memerlukan skrining dengan banyak enzim restriksi (Zulfahmi, 2013).


Sumber rujukan/Daftar pustaka:

Arisetianingsih RED, Totok ADH, and Prakoso B, 2010. Keragaman genetik kedelai berdasarkan pola pita DNA hasil RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). Agrin. Vol 14(1):37-43.

Karp A, Seberg O, and Buiatti M, 1996. Molecular Techniques in the Assessment of Botanical Diversity. Annals of Botany. Vol 78(2): 143-149.http://aob.oxfordjournals.org/content/78/2/143.short.

Matsumoto A, and Tsumara Y, 2004. Evaluation of Cleaved Amplified Polymorphic Sequence Markers. Theoretical and Applied Genetic. 110:80-91.

Morgante M, and Oliveari AM, 1993. PCR-Amplified SSRs as markes in plant genetic. Plant J.3:175-182.

Sutarno, 1999. Polimoephisme DNA mitokondria dari berbagai jenis sapi pedaging di Westerm Australia dan Bali. Surakarta: Universits Sebelas Maret.

Vos P, Hogers R, Bleeker M, Rejian M, Vandelee T, Hornes M, Frijters A, Pot J, Peleman J, Kuiper M, and Zabeau M, 1995. AFLP: A new techniques for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research. 23:4407-4414.

Weising K, Nybon H, Wolf K, and Kahl G, 2005. DNA Fingerprinting in Plants: Principles, Methods and Application. Second Edition. Taylor & Francis Group. Boca Raton.

Zulfahmi, 2013. Penanda DNA untuk analisis genetik tanaman. Jurnal Agroekoteknologi. Vol 3(2):41-52


No comments:

Post a comment